虚拟细胞扰动预测：敲低一个从未做过实验的基因，细胞会怎样变化？
生物医学信息学课程设计 · 选题九（吉林大学人工智能学院）
术语说明：课程题目使用“敲除”，本项目使用的公开 Perturb-seq 数据是 CRISPRi 敲低（knockdown），报告第 2 节解释了二者的差异；全文用“敲低”描述实验操作，用“敲除/敲低”指代题目中的基因功能缺失问题。
输入"细胞 + 基因扰动"，输出预测的扰动后细胞状态。 监督版本 PerturbFormer（在已测扰动上做知识核交叉注意力的检索增强 Transformer）预测平均表达变化与 DEG 方向； 高级版本 条件流匹配（Conditional Flow Matching）把预测展开为每个细胞的反事实状态。
评测设定：Replogle 2022 K562 必需基因 CRISPRi 筛选，按基因做 5 折交叉验证，1,092 个基因每个都作为训练时完全未见的基因被预测一次。模型设计和超参数只在开发集上比较，基线也经过同等调参；第 0 折的 219 个测试基因从未参与任何设计选择，在这一折上结论同样成立（报告第 8 节）。
| 模型 | Pearson Δ 全部基因 | Pearson Δ Top-20 DEG | 去偏 Pearson (Systema) | DEG 方向准确率 | 识别排名 ↓ |
|---|---|---|---|---|---|
| Mean-shift（均值平移） | 0.382 | 0.464 | 0.000 | 0.643 | 0.500 |
| Linear（Ahlmann-Eltze 2025）+KD | 0.526 | 0.696 | 0.430 | 0.793 | 0.222 |
| PerturbNet（Transformer + MLP）+KD | 0.552 | 0.738 | 0.443 | 0.847 | 0.191 |
| kNN 多源先验 +KD | 0.567 | 0.749 | 0.473 | 0.828 | 0.175 |
| PerturbFormer +KD（本文） | 0.573 | 0.746 | 0.480 | 0.833 | 0.174 |
| 测量噪声决定的可达上限 | 0.813 | 0.900 | 0.808 | — | — |
- 均值平移的全基因相关看似不差，但去偏 Pearson 为 0：它不含任何扰动特异信息。
- 上表为第一种划分、基线使用默认参数。基线在同一开发集上调参并换 3 种随机划分后：PerturbFormer 仍在全部指标上显著优于线性基线（去偏 Pearson +0.027）；与调参后的多源 kNN 在三项 Pearson 上持平（差 ≤ 0.004），但 DEG 方向准确率（+0.010）、Top-20 DEG 重合率（+0.015）和扰动识别排名在 3 种划分中都显著更好（18 次比较 15 优 1 平 2 劣；Holm 校正后计数不变）。核心收益来自多源知识检索这一思路。
- 已发表方法 GEARS（同样的未见基因，第 0 折）：原 CPU 预算（15 细胞/扰动、10 epoch、1,500 对照）下去偏 Pearson 0.249，PerturbFormer 0.504。随后在 GPU 上用 30/50 细胞、20 epoch、5,000 对照重跑（
results/replogle_k562_essential/gears_fair_comparison.md），GEARS+KD 仍只有 0.227/0.231，没有改善，也仍显著低于 PerturbFormer；因此原结论不是欠训练造成的（单折、单数据子集；50 细胞仍低于该数据的中位数 115）。 - 消融：去掉 GO（−0.029）、GenePT 语言模型嵌入（−0.024）、知识核注意力（−0.021）、STRING PPI（−0.020）都会显著下降；CRISPRi 敲低规则使 Top-20 DEG 相关提升 0.072。
- DEG 方向：全部约 67 万个显著 DEG 上方向准确率 87.8%（AUROC 0.946），变化幅度 > 0.2 的 DEG 达 93% 以上；错误集中在接近噪声的弱变化基因。
- 单细胞（条件流匹配）：相对只平移均值，能量距离 −7%、MMD −17%、方差误差 −17%（p < 1e-30）；但与免训练的“借用相似扰动细胞”基线持平（差异不显著）。流模型独有的是逐细胞反事实映射。潜空间每折只用训练细胞拟合。
- 第二个数据集（Adamson 2016，86 个扰动，同样的未见基因评测）：PerturbFormer 在所有指标上最优，去偏 Pearson 0.544（kNN 0.498，线性 0.476）。
- 跨实验室外部验证（Replogle → Adamson，全部为未见基因）：达到"直接重测同一基因"上限的 79–86%。
- 生物学解释：预测保留 CORUM 复合体与 Hallmark 通路结构（通路相关 r = 0.59）；核糖体、蛋白酶体、Mediator 等复合体成员最可预测；GATA1 这类谱系特异的主调控因子是明确的失败边界。
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完整报告：docs/report.md · 汇报 PPT：docs/VirtualCell-Perturb_汇报.pptx · 交互式浏览器：docs/explorer.html（浏览器直接打开）
答辩资料：答辩手册（原理逐层剖析 + 老师可能问的 76 个问题与回答口径 + 送命题 + 演示预案 + 关键数字速查）· 项目流程详解（14 个环节逐步说明：命令、输入、内部算法、输出文件、实测耗时、验证方法与踩坑）
| 课程 / 选题要求 | 本项目中的对应内容 |
|---|---|
| Problem 问题 | 未见基因敲低的转录响应预测；系统偏差陷阱与测量噪声（报告第 1 节） |
| Data 数据 | 两个公开 CRISPRi Perturb-seq 数据集 + GO / STRING / GenePT 先验（第 2 节，scripts/00–02） |
| control / perturbed 细胞表征 | 单细胞 PCA 潜空间、扰动应答谱、潜空间对未见扰动的覆盖（2.1 节，scripts/11_representation.py） |
| 扰动编码 | 四种知识 token：GO、PPI、GenePT、应答谱（3.1 节，src/vcp/embeddings.py） |
| 表达变化预测 | 基础版：Linear / kNN / PerturbNet；本文 PerturbFormer（3.2–3.3 节，src/vcp/models.py） |
| DEG 方向预测 | 方向损失 + Top-20 / 全部 DEG 方向准确率分层分析（5.7 节） |
| 高级版本：生成模型 / flow / Transformer | 条件流匹配（OT-CFM）生成单细胞，并与“借用相似扰动细胞”的强基线对比；PerturbFormer 本身是 Transformer（3.4、5.4 节，src/vcp/flow.py） |
| 最终成果：输入"细胞 + 基因"，输出扰动后状态 | scripts/predict.py、VirtualCell.predict()（第 7 节） |
| Benchmark 评测 | 5 折未见基因 CV × 3 种划分、基线同等调参、已发表方法 GEARS 对比、噪声上限、配对检验、消融、外部实验室验证（第 4–5 节） |
| Biological interpretation 解释 | 复合体、通路、案例、知识源权重、失败模式（第 6 节） |
| GitHub 代码 + 10 分钟汇报 | 本仓库；docs/VirtualCell-Perturb_汇报.pptx（16 页，讲稿约 9 分钟） |
pytest -q tests11 个不依赖数据的单元测试：统计函数与 scipy / statsmodels 对照、交叉验证划分不重叠、两项防泄露检查。推送到 GitHub 后由 .github/workflows/tests.yml 自动运行。
VirtualCell-Perturb/
├── run_all.sh # 一键复现全部结果（CPU，4 核约 4 小时）
├── tests/ # 单元测试（无需数据）
├── requirements.txt
├── src/vcp/ # Python 包
│ ├── data.py # Perturb-seq 读取、分块伪批量统计、Welch t / BH-FDR、划分
│ ├── embeddings.py # 扰动编码：GO / STRING PPI / 应答谱（GenePT 在 02 脚本）
│ ├── baselines.py # No-change、Mean-shift、Linear (Ahlmann-Eltze 2025)、kNN、KD 规则
│ ├── models.py # PerturbNet、PerturbFormer、KernelPerturbFormer（主模型）
│ ├── flow.py # 条件流匹配（OT-CFM）单细胞生成器
│ ├── metrics.py # Pearson Δ、DEG 方向、Systema 去偏、识别排名、能量距离、MMD
│ ├── interpret.py # 基因集、功能分类、富集分析、通路得分
│ ├── predictor.py # VirtualCell 用户 API
│ ├── pipeline.py # 数据 + 先验的统一加载
│ └── plotting.py # 统一绘图风格（经色盲校验的调色板）
├── scripts/
│ ├── 00_download_data.sh # 下载全部公开数据
│ ├── 01_preprocess.py # 伪批量统计 + 单细胞 PCA 潜空间
│ ├── 02_build_embeddings.py # 先验知识嵌入（扰动基因 + 全基因组约 2.1 万基因）
│ ├── 03_benchmark.py # 5 折未见扰动评测（全部模型 + 消融）
│ ├── 03b_dev_sweep.py # 仅在开发集上的超参数扫描
│ ├── 03c_split_robustness.py # 3 种随机划分下的稳健性汇总
│ ├── 03d_baseline_tuning.py # 基线在同一开发集上调参后重新评估
│ ├── 04_noise_ceiling.py # 细胞拆半噪声天花板
│ ├── 05_flow.py # 条件流匹配训练与单细胞评测（含“借用细胞”基线、--dev 开发模式）
│ ├── 06_external_validation.py # Replogle → Adamson 跨实验室验证
│ ├── 07_interpretation.py # 生物学解释
│ ├── 08_train_final.py # 用全部扰动训练可部署模型
│ ├── 09_figures.py # 评测图表与统计检验
│ ├── 10_export_explorer.py # 交互式网页
│ ├── 11_representation.py # 细胞与扰动的表征分析
│ ├── 12_gears_baseline.py # 已发表方法 GEARS 对比（可选）
│ └── predict.py # 命令行：细胞 + 基因 → 扰动后状态
├── results/ # 指标表（csv / md）
├── figures/ # 全部图
└── docs/ # 报告、汇报 PPT、交互式浏览器
python -m venv .venv && source .venv/bin/activate
pip install torch --index-url https://download.pytorch.org/whl/cpu
pip install -r requirements.txt
bash run_all.sh # 或按 run_all.sh 中的顺序逐步运行单独使用训练好的虚拟细胞（仓库已包含 models/k562/，约 79 MB，克隆后可直接运行；若只想从代码重建，可删除权重后运行 scripts/08_train_final.py）：
python scripts/predict.py --gene GATA1 # 300 个 K562 对照细胞，GATA1 视为未见基因
python scripts/predict.py --gene MED12 --cells my_cells.h5ad # 自己的细胞（log 归一化表达）
python scripts/predict.py --gene TP53 # 筛选中从未扰动过的任意基因每次预测都会给出可靠性评级（高 / 中 / 低）：依据查询基因与已测扰动的先验相似度，按交叉验证结果校准（三档平均去偏 Pearson 0.32 / 0.47 / 0.65）。
from vcp.predictor import VirtualCell
vc = VirtualCell.load("models/k562", gmt="data/raw/genesets/MSigDB_Hallmark_2020.gmt")
out = vc.predict("GATA1", cells=X_ctrl) # X_ctrl: (n, 5000) 对照细胞
out["cells"] # (n, 5000) 这些细胞被敲低后的预测表达
out["delta"] # (5000,) 伪批量变化
out["neighbors"] # 预测所依据的已测扰动及注意力权重
print(vc.report(out))| 数据集 | 内容 | 用途 |
|---|---|---|
| Replogle et al., Cell 2022 — K562 essential | CRISPRi，1,092 个基因敲低，162,751 细胞 × 5,000 基因 | 训练与 5 折未见基因评测 |
| Adamson et al., Cell 2016 — UPR | CRISPRi，86 个基因敲低，68,603 细胞 | 跨实验室外部验证 |
| Gene Ontology（GEARS gene2go） | 基因功能注释 | 扰动编码 |
| STRING v12 | 人类蛋白互作网络 | 扰动编码 |
| GenePT（Chen & Zou 2024） | GPT 嵌入的 NCBI 基因摘要 | 扰动编码（语言模型先验） |
| MSigDB Hallmark、GO BP、CORUM | 基因集与蛋白复合体 | 生物学解释 |
所有数据由 scripts/00_download_data.sh 从公开来源下载（Harvard Dataverse、STRING、Zenodo、Enrichr）。
- Replogle J.M. et al. Mapping information-rich genotype-phenotype landscapes with genome-scale Perturb-seq. Cell 2022.
- Adamson B. et al. A multiplexed single-cell CRISPR screening platform enables systematic dissection of the unfolded protein response. Cell 2016.
- Roohani Y., Huang K., Leskovec J. Predicting transcriptional outcomes of novel multigene perturbations with GEARS. Nat Biotechnol 2024.
- Ahlmann-Eltze C., Huber W., Anders S. Deep-learning-based gene perturbation effect prediction does not yet outperform simple linear baselines. Nat Methods 2025.
- Viñas Torné R. et al. Systema: a framework for evaluating genetic perturbation response prediction beyond systematic variation. Nat Biotechnol 2025.
- Lipman Y. et al. Flow matching for generative modeling. ICLR 2023; Tong A. et al. Improving and generalizing flow-based generative models with minibatch optimal transport. TMLR 2024.
- Chen Y., Zou J. GenePT: a simple but effective foundation model for genes and cells built from ChatGPT. bioRxiv 2024.
- Peidli S. et al. scPerturb: harmonized single-cell perturbation data. Nat Methods 2024.
- Bunne C. et al. How to build the virtual cell with artificial intelligence: priorities and opportunities. Cell 2024.