Decifrando o genoma do SARS-Cov-2

O presente repositório contêm os scripts para análise de dados de sequenciamento de DNA de um isolado de SARS-Cov-2, um coronavírus causar da doença COVID19. Os dados usados de exemplo estão disponíveis no banco de dados NCBI SRA com o código de acesso SRR24146463. Todos os scripts estão na pasta scripts/.

Instalando as dependências

Para instalar as dependências do projeto, basta clonar o repositório e utilizar o alguma distribuição do conda (ex: anaconda, miniconda, miniforge, mamba) para configurar o ambiente.

$ git clone https://github.com/fredericokremer/sars-cov-2
$ cd sars-cov-2
$ conda env create

Agora é necessário ativar o ambiente do Conda.

$ conda activate sars-cov-2

Passo 1: download dos dados

Para baixar os dados do NCBI SRA podemos utilizar o script step_1_download.sh com o comando:

c Este script utilizará a ferramenta fastq-dump para baixar os dados brutos de sequenciamento do NCBI SRA e salvará estes em um arquivo na pasta data/raw com o nome reads.fastq.

Passo 2: controle de qualidade

Agora utilizaremos a ferramenta fastqc para analisar a qualidade das leituras obtidas durante o sequenciamento. Para isso, vamos utilizar o script step_2_quality_control.sh:

$ bash scripts/step_2_quality_control.sh

O relatório do controle de qualidade ficará salvo na pasta data/raw_qc. Com base nesse relatório, podemos escolher quais pedaços das leituras vamos "cortar" na próxima etapa.

Passo 3: remoção de artefatos

Artefatos são regiões de baixa qualidade e/ou contaminantes presentes nas sequências lidas pelo sequenciador. A partir do relatório de qualidade do fastqc podemos identificar estes artefatos, e remover regiões onde eles estão ocorrendo. Para isso utilizaremos a ferramenta NanoFilt, que pode ser executada com o script scripts/step_3_remove_artifacts.sh. As leituras filtradas serão salvas na pasta data/filtered.

$bash scripts/step_3_remove_artifacts.sh

Passo 4: identificação de variantes e montagem

Com os artefatos removidos, realizaremos a montagem do genoma do isolado de SARS-Cov-2 utilizando como referência o genoma da cepa originalmente isolada em Wuhan no começo da pandemia. Para isso primeiro é necessário se aplicar as leituras contra a referência utilizando a ferramenta minimap2, e depois aplicar algumas funções dos programas samtools e bcftools para converter estes alinhamentos em uma sequência "consenso". Todas estas etapas podem ser realizadas com o script step_4_variant.sh, e os arquivos intermediários ficarão salvos na pasta data/variants, sendo um deles o arquivo genome.fasta, que contêm a sequência do genoma montado.

$ bash scritps/step_4_variant.sh

Passo 5: classificação da linhagem

Agora que temos o genoma montado, é possível se identificar a linhagem mais próxima (segundo a nomenclatura utilizada pela OMS) com da ferramenta pangolin, que pode ser executada com o script step_5_classify.sh. O resultado será o arquivo data/classification/lineage_report.csv, com a seguinte tabela:

taxon	lineage	conflict	ambiguity_score	scorpio_call	scorpio_support	scorpio_conflict	scorpio_notes	version	pangolin_version	scorpio_version	constellation_version	is_designated	qc_status	qc_notes	note
new_isolate|reference=NC_045512.2 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1, complete genome	BA.1.1.1	0.0		Probable Omicron (Unassigned)	0.72	0.28	scorpio call: Alt alleles 23; Ref alleles 9; Amb alleles 0; Oth alleles 0	PUSHER-v1.22	4.3	0.3.19	v0.1.12	False	pass	Ambiguous_content:0.02	Usher placements: BA.1.1.1(1/1); scorpio found insufficient support to assign a specific lineage