Análise de variantes somáticas com GATK Mutect2

Tutorial prático para compreender uma chamada de variantes somáticas com dados tumor–normal, estimativa de contaminação, filtragem e anotação funcional.

Finalidade educacional. Os arquivos são pequenos recortes genômicos preparados para aula. Este repositório não constitui um pipeline clínico validado e seus resultados não devem ser usados para diagnóstico.

O que você aprenderá

Ao concluir o exercício, você será capaz de:

• reconhecer os arquivos necessários para uma análise tumor–normal;
• verificar a compatibilidade entre os contigs do BAM, FASTA e VCF;
• executar Mutect2, GetPileupSummaries, CalculateContamination e FilterMutectCalls;
• comparar uma análise pareada com uma análise tumor-only usando Panel of Normals (PoN);
• identificar variantes que passaram pelos filtros e preparar o VCF para anotação com VEP.

Escopo e versões

Componente	Configuração deste exercício	Observação
Referência	GRCh37/hg19, somente os contigs usados nos exemplos	Mantida por compatibilidade com os BAMs e VCFs didáticos
Nomes dos contigs	9, 13 e 19, sem o prefixo chr	Todos os arquivos de entrada precisam usar a mesma convenção
GATK	4.6.2.0	Versão fixada para reprodutibilidade
VEP	imagem Docker release_116.0	Executado em modo database; requer internet

Para projetos novos, escolha a montagem de referência e os recursos populacionais de forma explícita. Não misture GRCh37/hg19 com GRCh38, nem arquivos com e sem o prefixo chr.

Visão geral do fluxo

1. Preparar e indexar a referência FASTA.
2. Confirmar o identificador da amostra normal no read group do BAM.
3. Chamar SNVs e indels somáticos com Mutect2.
4. Estimar contaminação com os sítios populacionais do gnomAD.
5. Filtrar as chamadas.
6. Inspecionar variantes PASS e, opcionalmente, anotar com VEP.

Arquivos incluídos

Arquivo	Papel no exercício
tumor_JAK2.bam / .bai	Recorte tumoral da região de JAK2 no cromossomo 9
normal_JAK2.bam / .bai	Normal pareado do exemplo JAK2
tumor_wp017.bam e tumor_wp018.bam	Par tumor–normal adicional
tumor_wp190.bam e tumor_wp191.bam	Par tumor–normal adicional
af-only-gnomad-*.vcf.gz / .tbi	Sítios populacionais usados pelo Mutect2 e pela estimativa de contaminação
somatic.Pon.vcf	Pequeno VCF de exemplo; não substitui o PoN oficial usado na atividade
run.chr13-chr19.sh	Pipeline tumor–normal para os exemplos dos cromossomos 13 e 19
run.chr13-chr19.pon.sh	Pipeline tumor-only com PoN
vep-docker.sh	Anotação do VCF filtrado com VEP em Docker
somatico_google_colab.ipynb	Aula guiada para Google Colab

Início rápido: exemplo JAK2

1. Pré-requisitos

Para a execução local, instale:

• Bash;
• wget, gzip e unzip;
• samtools;
• Java compatível com a versão do GATK;
• Docker, apenas para a etapa opcional com VEP.

Clone o repositório:

git clone https://github.com/renatopuga/somatico.git
cd somatico

Alternativamente, abra o notebook no Colab:

2. Baixar o GATK

wget -c https://github.com/broadinstitute/gatk/releases/download/4.6.2.0/gatk-4.6.2.0.zip
unzip gatk-4.6.2.0.zip
./gatk-4.6.2.0/gatk --version

3. Preparar a referência do cromossomo 9

Os BAMs do exercício usam o contig 9, enquanto o FASTA da UCSC usa chr9. O comando abaixo remove o prefixo somente do cabeçalho FASTA.

wget -c https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/chromosomes/chr9.fa.gz
zcat chr9.fa.gz | sed '/^>/ s/^>chr/>/' > chr9.fa

samtools faidx chr9.fa
./gatk-4.6.2.0/gatk CreateSequenceDictionary \
  -R chr9.fa \
  -O chr9.dict

./gatk-4.6.2.0/gatk ScatterIntervalsByNs \
  -R chr9.fa \
  -O chr9.interval_list \
  -OT ACGT

Verifique se os três recursos usam o mesmo contig:

samtools view -H tumor_JAK2.bam | grep '^@SQ' | head
grep '^>' chr9.fa | head
bcftools view -h af-only-gnomad-chr9.vcf.gz | grep '^##contig' | head

4. Confirmar o nome da amostra normal

O valor informado em -normal deve ser exatamente igual ao campo SM do read group:

samtools view -H normal_JAK2.bam \
  | awk -F '\t' '$1=="@RG" {for (i=1; i<=NF; i++) if ($i ~ /^SM:/) {sub(/^SM:/,"",$i); print $i}}'

Para os arquivos deste exemplo, o identificador esperado é WP044.

5. Executar Mutect2 e estimar contaminação

./gatk-4.6.2.0/gatk Mutect2 \
  -R chr9.fa \
  -I tumor_JAK2.bam \
  -I normal_JAK2.bam \
  -normal WP044 \
  --germline-resource af-only-gnomad-chr9.vcf.gz \
  -L chr9.interval_list \
  -O somatic.vcf.gz

./gatk-4.6.2.0/gatk GetPileupSummaries \
  -R chr9.fa \
  -I tumor_JAK2.bam \
  -V af-only-gnomad-chr9.vcf.gz \
  -L chr9.interval_list \
  -O tumor_JAK2.table

./gatk-4.6.2.0/gatk GetPileupSummaries \
  -R chr9.fa \
  -I normal_JAK2.bam \
  -V af-only-gnomad-chr9.vcf.gz \
  -L chr9.interval_list \
  -O normal_JAK2.table

./gatk-4.6.2.0/gatk CalculateContamination \
  -I tumor_JAK2.table \
  -matched normal_JAK2.table \
  -O contamination.table

6. Filtrar e inspecionar as chamadas

./gatk-4.6.2.0/gatk FilterMutectCalls \
  -R chr9.fa \
  -V somatic.vcf.gz \
  --contamination-table contamination.table \
  -O filtered.vcf.gz

bcftools view -f PASS filtered.vcf.gz

O VCF bruto preserva evidências candidatas; o VCF filtrado adiciona decisões no campo FILTER. Em uma análise real, revise também profundidade, VAF, qualidade, orientação das reads, artefatos técnicos e evidência clínica.

Exemplos dos cromossomos 13 e 19

Prepare uma referência combinada com nomes de contig compatíveis:

wget -c https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/chromosomes/chr13.fa.gz
wget -c https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/chromosomes/chr19.fa.gz
zcat chr13.fa.gz chr19.fa.gz | sed '/^>/ s/^>chr/>/' > hg19.fa

samtools faidx hg19.fa
./gatk-4.6.2.0/gatk CreateSequenceDictionary -R hg19.fa -O hg19.dict
./gatk-4.6.2.0/gatk ScatterIntervalsByNs -R hg19.fa -O hg19.interval_list -OT ACGT

Pipeline tumor–normal:

bash run.chr13-chr19.sh tumor_wp017.bam tumor_wp018.bam WP017 WP018
bash run.chr13-chr19.sh tumor_wp190.bam tumor_wp191.bam WP190 WP191

Os resultados são gravados em results/. Você pode alterar os caminhos por variáveis de ambiente:

GATK_CMD=/caminho/para/gatk \
GENOME=/referencias/hg19.fa \
GNOMAD=/referencias/af-only-gnomad-chr13-chr19.vcf.gz \
INTERVALS=/referencias/hg19.interval_list \
OUTPUT_DIR=results \
bash run.chr13-chr19.sh tumor.bam normal.bam TUMOR_ID NORMAL_ID

Tumor-only com Panel of Normals

Baixe o PoN compatível com GRCh37/b37:

wget -c https://storage.googleapis.com/gatk-best-practices/somatic-b37/Mutect2-exome-panel.vcf
wget -c https://storage.googleapis.com/gatk-best-practices/somatic-b37/Mutect2-exome-panel.vcf.idx

Execute informando apenas o BAM tumoral e seu identificador:

bash run.chr13-chr19.pon.sh tumor_wp190.bam WP190

O PoN ajuda a remover artefatos recorrentes, mas não substitui um normal pareado. Para uso real, o PoN deve ser construído e validado com amostras normais processadas de modo comparável à coorte analisada.

Anotação opcional com VEP

Com Docker instalado, o script aceita o VCF de entrada e o TSV de saída:

bash vep-docker.sh filtered.vcf.gz vep_output/filtered.vep.tsv

Por padrão, o script usa GRCh37, RefSeq e a imagem ensemblorg/ensembl-vep:release_116.0. Como o modo database consulta serviços externos, a execução requer internet e pode variar conforme a disponibilidade do Ensembl.

Saídas principais

Saída	Conteúdo
*.somatic.vcf.gz	Chamadas candidatas produzidas pelo Mutect2
*.pileups.table	Contagens usadas para estimar contaminação
*.contamination.table	Fração estimada de contaminação
*.filtered.vcf.gz	Chamadas com os filtros do Mutect2
*.vep.tsv	Consequências anotadas pelo VEP

Problemas frequentes

• Contigs incompatíveis: compare os cabeçalhos do BAM, FASTA e VCF. 9 e chr9 são nomes diferentes.
• Normal sample not found: confirme o campo SM com samtools view -H e use exatamente esse valor em -normal.
• Arquivo sem índice: BAM requer .bai; FASTA requer .fai e .dict; VCF compactado requer .tbi ou .csi.
• Recurso de montagem incorreta: todos os arquivos devem pertencer à mesma montagem e à mesma convenção de contigs.
• VEP sem conexão: repita mais tarde ou configure cache/FASTA local para uma execução offline reprodutível.

Referências

• GATK: somatic short variant discovery
• GATK Mutect2
• Diferenças entre GRCh37, hg19 e b37
• Ensembl Variant Effect Predictor

Licença

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